自剪接內含子（核酶）是具有催化活性的RNA，主要參與RNA的加工與成熟。與蛋白酶類似，核酶也會折疊成高級結構發揮功能。RNA在一級序列的基礎上形成局部的helix、loop等二級結構元件，再在金屬離子的幫助下進一步折疊成具有酶活中心的三級結構，在無需蛋白質的情況下催化反應。但由于RNA的異質性和靈活性，使RNA結構的解析受到了很大的挑戰，限制了人們對其結構和功能間聯系的理解。

在許多生物體中，I型核酶通過兩個連續的酯交換反應催化自身從RNA前體中切除。嗜熱四膜蟲I型核酶是第一個被發現的核酶，自20世紀80年代被發現以來，大量的生物化學和遺傳學研究已經闡明了四膜蟲核酶的潛在催化機制，但獲得其全長分子的三維（3D）結構以及其催化功能所需的3D結構中的詳細重排一直是重大的科學挑戰。張凱銘等團隊此前首次解析了四膜蟲核酶的全長結構（Nature 2021），并解析了多個不同構象錯誤折疊的四膜蟲核酶結構（PNAS 2022），為冷凍電鏡解析高分辨率RNA結構做出了表率。

為了解析四膜蟲核酶催化的結構基礎以及伴隨兩步自剪接反應的構象變化，張凱銘課題組分別進行了第一步和第二步剪接反應底物的設計，并通過冷凍電鏡解析了四膜蟲核酶第一步剪接過程中的四種構象（Nucleic Acids Research 2023）和第二步剪接過程中的六種構象（Nature Communications 2023），深入剖析了四膜蟲核酶的剪接機制。

研究人員首先在體外驗證了設計后的底物可以完成催化反應，并確定了核酶與底物的最優反應條件，然后利用單顆粒冷凍電鏡在解析高異質性或靈活性的樣品方面的獨特優勢，捕獲了四膜蟲核酶自剪接過程中的多種不同構象（圖1）。

圖1.冷凍電鏡解析四膜蟲核酶兩步自剪接過程中的多種不同構象。

通過結構比對，在四膜蟲核酶的第一步剪接反應過程中，核酶5′端的IGS/IGSext與5′剪接底物配對形成P1/P1ext雙鏈（pre-dock-1S），其會圍繞J1/2發生~50 ?的移動將底物帶至核酶催化活性中心（pre-1S）。P1和催化活性中心內的三個單鏈片段(J8/7、J4/5、J5/4)之間的三級相互作用介導了P1/P1ext雙鏈的正確定位。隨后，早已占據活性位點的外源GTP的3′-OH對5′剪接位點進行親核攻擊，完成第一步轉酯反應（post-1S）。在第二步剪接反應過程中，3'剪接底物取代外源GTP，P7ext形成并引導3' -剪接底物結合，形成部分P10雙鏈 (intermediate pre-2S)。隨后完整P10雙鏈的形成使3'剪接位點靠近酶活位點，為第二次酯交換反應做好準備（pre-2S）。完成第二步轉酯反應后（post-2S），P1/P10雙鏈離開活性位點，圍繞J1/2發生~50 ?的移動將連接產物帶至無底物位點（pre-release 2S），然后經歷解旋過程釋放產物（releasing states）。概況來說，在四膜蟲核酶的自剪接過程中，核酶發揮功能的同時伴隨著構象的顯著改變，這種變化主要集中在核酶5′端的IGS/IGSext（圖2）。此外，研究人員發現除構象改變外，活性位點的金屬離子和一些氫鍵也會發生細微重排，以促進催化和協調自剪接反應。

圖2．自剪接過程中四膜蟲核酶構象變化的示意圖。P表示堿基配對區域。

這些研究結果使得核酶的功能在原子水平上得到了更好的剖析，并突出了冷凍電鏡捕獲動態RNA結構改變的能力。隨著冷凍電鏡在結構異質性分子中應用的不斷推進，研究人員預計它將成為探索越來越多生物學上有趣的研究課題的關鍵工具，比如RNA系統的折疊和組裝。

中國科學技術大學生命科學與醫學部的博士研究生張曉靜和李珊珊副研究員為（Nucleic Acids Research 2023）的共同第一作者，李珊珊副研究員為（Nature Communications 2023）的第一作者，張凱銘教授和李珊珊副研究員為兩篇文章的共同通訊作者。這兩項工作中冷凍樣品初篩、數據收集與處理在中國科學技術大學冷凍電鏡中心完成，該工作也獲得了細胞動力學重點實驗室的大力支持。研究工作的開展得到了科技部重點研發計劃、中科大科研啟動經費和中科院率先行動引才計劃擇優經費的資助。

原文鏈接:

https://academic.oup.com/nar/article/51/3/1317/6993854

https://www.nature.com/articles/s41467-023-36724-5

（生命科學與醫學部、科研部）